二代测序几乎是现代低成本，高通量的核酸组学的基础。需要明确，二代测序技术不仅用于基因组测序，在 RNA-seq 等多种与核酸相关的组学技术中，都通过不同途径产生 DNA 序列后，应用了二代测序技术。
Illumina
1. 文库构建
- 将基因组 DNA 破碎，形成 200-300 bp 的短片段
- 为片段加上 A 尾后加上测序接头（原理类似 T 载体克隆），每个接头包括
- Index 片段，用于在混合测序时区分样品来源
- 测序引物结合位点
- 流动槽捕获位点
2. 流动槽吸附
- 流动槽的核心构成是一块玻璃板，上面附着了大量的接头片段，这些接头可以与 DNA 文库的接头互补，将待测序的 DNA 捕获在玻璃板上
- 将 DNA 文库片段加入流动槽，在碱基互补配对后，片段被分散地固定在了流动槽上
- 由于此时固定在接头上的片段仅靠碱基互补结合，需要先进行一次扩增。扩增产生的子链从与流动槽共价连接的接头开始延伸，因此新合成的子链通过共价键与流动槽紧密连接，而原来的模板链将在液流的冲洗下被洗掉
3. DNA 簇生成——桥式 PCR
- 在上一步完成后，所有文库的一条链均被紧密连接到了流动槽上。但显然，一条链产生的信号强度是远远不足的。因此要在桥式 PCR 的扩增下，产生 DNA 簇
- 桥式 PCR 的原理见下图，经 25 个循环后，产生 5000-10000 个拷贝。由于这是一种固相 PCR，以同一模板产生的子链都聚集在一起，产生了 DNA 簇。就像培养基上的菌落一样，每一个簇就是一个序列的单克隆。
- 此时，将 DNA 解链，可以发现每一簇中，既有正链（模板链），也有反链（子链）。这是没法测序的。使用化学试剂剪切 DNA 反链，再使用液流进行冲洗，便只留下的正链。
4. 边合成边测序
- 同 sanger 测序一样，边合成便测序方法中也使用了带荧光标记的 dNTP，且这种 dNTP 的 3’ 基团被一个叠氮基修饰，使得一轮扩增**只能延伸一个碱基。
- 当一个碱基连接后，使用激光扫描，便可以读取这个位置的碱基。
- 使用液流将多余 dNTP 冲洗掉，再用试剂去除叠氮基并淬灭荧光，便可以进行下一轮单碱基扩增。
- 如此往复，便可以将数百个碱基全部读出。
5. 双端测序
- 双端测序可以通过同时读取正链和反链，大幅提高测序的精度和读长。
- 在（4）中，完成正链的测序后，再进行一次桥式 PCR，将反链重新合成。
- 这次，与（3）中相反，使用试剂剪切正链并洗脱，重新测序，便得到了反链的序列。