Note
利用不同方法降低噪声突破光学显微镜分辨率极限的显微技术
全内反射荧光显微镜 TIRFM
原理
- 当光从高折射率物质进入低折射率介质的角度大于某个关键度数时，光被全部返回原介质即全反射现象
- 此时仅激发在靠近两种介质界面的低折射介质中的一层薄层内的荧光分子
- 仅全反射界面被激发，因此大大降低噪声
优势
- 背景噪音低，提高了纵向分辨率和信噪比。适合研究细胞表面的现象，如胞吞作用、细胞骨架动态变化、单分子动态变化等
局限
- 需要细胞紧贴全反射界面，故只适用于动物细胞，植物细胞 由于细胞壁的存在在不适用
- 植物细胞可以使用 VAEM 观察
PALM/STORM 方法
PLAM 方法
- 光激活定位显微技术（photoactivated localization microscopy）
- 原理：PA-GFP 的激活机制
- PA-GFP 需要先被405nm 激光激活一段时间后，才能在488nm 激光照射下发出绿色荧光的机制，每次仅激发单个（几个）荧光分子，由此降低噪音
- 对于激发的单荧光，通过数学方法进行拟合，进行 纳米级 定位
STORM 方法
- 随机光学重构显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy）
- 原理：成对的花青素染料（Cy3/Cy5）
- 使 Cy5 失活
- 随机激活 Cy3，Cy3 进一步活化 Cy5
- 最后激活 Cy5，利用数学方法进行拟合定位
4Pi 技术
- 4Pi是空间立体角的数值。基于增加物镜的接受角（等效增加物镜的NA）可以提高分辨率的原理。通过样品前后的双物镜使总的接受角接近4Pi，进而提高分辨率
受激发射损耗技术 STED
- stimulated emission depletion
- 由于光学元件的衍射效应，平行入射的照明光经过显微物镜聚焦之后在样品上所成的光斑并不是一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑，限制了显微系统的分辨率
- 一个典型的STED显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光（面包圈状，高强度脉冲激光）。激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，而损耗光使得部分处于激发光斑外围的发光物质从受激状态回到基态。这样只有激发光斑中心部分没有完全损耗的荧光分子能被探测器接受到。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率
结构照明显微技术 SIM
- 结构光照明荧光显微镜是基于常规荧光显微镜，通过对其照明方式的改 进，以特定结构光成像，从而突破衍射极限，获得高分辨率样品信息
- 比STED、PALM/STORM更适合活细胞超高分辨率成像，适用普通的免疫荧光标记样本，和各种荧光蛋白