一、翻译发生的空间位置与时间关系
- 原核生物：
- 空间： 转录和翻译在细胞质中偶联进行。 由于没有细胞核，mRNA 在转录的同时，其 5’端一旦合成出来，核糖体就可以立即结合并开始翻译。
- 时间： 高度偶联。 一条 mRNA 上可以同时进行多个核糖体的翻译（形成多聚核糖体），且翻译常在 mRNA 尚未完全转录完成时就已经开始。这大大提高了基因表达的效率，使其能快速响应环境变化。
- 真核生物：
- 空间： 转录在细胞核内，翻译在细胞质中完全分离进行。 mRNA 必须在细胞核内完成转录、5’加帽、剪接、3’切割加 polyA 尾等加工过程，并通过核孔复合体转运到细胞质后，才能被核糖体识别并结合，启动翻译。
- 时间： 严格分离。 翻译必须等待成熟的 mRNA 完全加工并转运至细胞质后才能开始。这种分离允许在 mRNA 输出前进行严格的质量控制和调控（如无义介导的 mRNA 降解 NMD）。
二、 mRNA 的结构特征与起始识别
- 原核生物：
- 5’端： 无帽子结构（m⁷G cap）。 mRNA 通常是多顺反子（polycistronic），即一条 mRNA 编码多个蛋白质（操纵子结构）。每个编码区（顺反子）有自己的起始密码子（AUG，少数为 GUG/UUG）和终止密码子。
- 起始识别： 核糖体小亚基通过Shine-Dalgarno (SD) 序列识别起始位点。
- SD 序列： 位于起始密码子 AUG 上游约 4-14 个核苷酸处的一段富含嘌呤（特别是 AGGAGG 或其变体）的短序列。
- 机制： 核糖体小亚基的 16S rRNA 3’端有一段富含嘧啶的反 SD 序列（anti-SD sequence，如 CCUCC）。SD 与 anti-SD 序列通过碱基互补配对结合，将核糖体小亚基精确定位到起始密码子 AUG 的位置。
- 特点： 这种识别方式允许多顺反子 mRNA 上的不同编码区独立起始翻译。
- 真核生物：
- 5’端： 具有特殊的 7-甲基鸟苷酸帽子结构（m⁷G cap）。 这是 mRNA 成熟的重要标志，几乎所有细胞质 mRNA 都有（某些病毒例外）。帽子结构在转录早期即被加到新生 RNA 上。
- 结构： mRNA 通常是单顺反子（monocistronic），即一条成熟 mRNA 通常只编码一个蛋白质（虽然最初转录本可能包含多个外显子，但剪接后通常只产生一个开放阅读框 ORF）。
- 起始识别： 核糖体小亚基主要通过识别5’帽子结构（m⁷G cap） 来起始翻译。这是一个扫描模型（Scanning Model）：
- 帽子结合： 真核起始因子 eIF4F 复合物（核心成分是帽子结合蛋白 eIF4E）首先结合到 mRNA 的 5’帽子上。
- 小亚基募集与扫描准备： eIF4F 招募其他起始因子（如 eIF4G, eIF4A, eIF4B）和携带起始 tRNA（Met-tRNAiᴹᵉᵗ）的 40S 小亚基（此时小亚基已结合了 eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5 和 eIF2-GTP-Met-tRNAiᴹᵉᵗ复合物），形成43S 前起始复合物。eIF4G 作为桥梁连接 eIF4E（结合帽子）和 eIF3（结合在 43S 复合物上）。
- 扫描： 在 eIF1, eIF1A, eIF4A/B（RNA 解旋酶活性）等因子的协助下，43S 复合物从 5’端帽子开始，沿着 mRNA 5’→3’方向扫描移动，解开可能存在的二级结构，寻找合适的起始密码子（通常是第一个 AUG）。
- 起始密码子识别： 当扫描到符合“Kozak 序列”（GCCRCCAUGG，其中 R 是嘌呤，AUG 是起始密码子）的上下文环境时，扫描停止。eIF2 水解 GTP，在 eIF5 和 eIF5B 的促进下，释放起始因子，60S 大亚基结合上来，形成完整的 80S 起始复合物，起始 tRNA（Met-tRNAiᴹᵉᵗ）占据 P 位点。
- 特点： 扫描模型依赖于 5’帽，确保了翻译通常从最靠近 5’端的 AUG 开始（虽然 Kozak 序列上下文影响效率），符合单顺反子 mRNA 的结构。无帽 mRNA（如某些病毒或内部核糖体进入位点 IRES）采用非帽依赖的起始机制。
三、起始 tRNA 与第一个氨基酸
- 原核生物：
- 起始 tRNA： fMet-tRNAfᴹᵉᵗ（甲酰甲硫氨酰 tRNA）。
- 第一个氨基酸： 甲酰甲硫氨酸（fMet）。甲硫氨酸被甲酰化修饰（由转移酶催化），使其区别于延伸时的甲硫氨酰 tRNA（Met-tRNAmᴹᵉᵗ）。fMet 通常会在蛋白质合成后被切除或去甲酰化。
- 真核生物：
- 起始 tRNA： Met-tRNAiᴹᵉᵗ（甲硫氨酰起始 tRNA）。
- 第一个氨基酸： 甲硫氨酸（Met）。不需要甲酰化修饰。这个起始 Met 也可能在后续加工中被切除（尤其是当第二个氨基酸是特定类型时）。
四、起始因子 (Initiation Factors, eIFs/IFs)
- 原核生物：
- 数量较少： 主要有三个核心起始因子：IF1, IF2, IF3。
- 功能：
- IF3: 防止 30S 小亚基过早与 50S 大亚基结合；促进 mRNA（SD 序列）与小亚基的结合；帮助维持起始 tRNA（fMet-tRNAfᴹᵉᵗ）在 P 位的正确位置。
- IF1: 结合在 A 位，阻止氨基酰-tRNA 过早进入；增强 IF2 和 IF3 的活性。
- IF2 (GTPase): 负责将 fMet-tRNAfᴹᵉᵗ结合到 30S 小亚基的 P 位点（需要 GTP）；促进 50S 大亚基的结合（伴随 GTP 水解）。
- 真核生物：
- 数量众多且复杂： 超过 12 种真核起始因子（eIFs），参与多个步骤，形成复杂的调控网络。
- 核心功能与代表因子：
- 帽子识别与结合： eIF4E (帽子结合蛋白), eIF4G (支架蛋白), eIF4A (RNA 解旋酶), eIF4B (刺激 eIF4A 活性)。
- 43S 前起始复合物组装： eIF1, eIF1A (促进扫描和正确起始密码子选择), eIF3 (大型多亚基复合物，结合 40S 小亚基，招募其他因子，抑制大小亚基结合), eIF5 (GTP 酶激活蛋白 GAP，促进 eIF2 的 GTP 水解), eIF5B (GTPase，促进 60S 亚基结合，功能类似原核 IF2)。
- 起始 tRNA 装载 (最关键调控点之一)： eIF2 (GTPase): 与 GTP 和 Met-tRNAiᴹᵉᵗ形成三元复合物 (eIF2•GTP•Met-tRNAiᴹᵉᵗ)，将其运载到 40S 小亚基。eIF2 的活性受到磷酸化的严格调控（如通过 eIF2 激酶响应压力：PKR, PERK, GCN2, HRI）。eIF2α亚基被磷酸化会抑制 eIF2B（鸟苷酸交换因子 GEF）的作用，阻止 GDP-GTP 交换，从而全局抑制翻译起始。
- 扫描与起始密码子识别： eIF1, eIF1A, eIF2, eIF5, eIF3。
- 大亚基结合： eIF5B (GTPase)。
- 特点： eIFs 提供了更多层次的调控点，尤其是 eIF2 磷酸化对全局翻译的调控，以及 eIF4F 复合物（特别是 eIF4E）的组装受 mTOR 等信号通路调控，影响特定 mRNA 的翻译效率。
五、延伸 (Elongation)
延伸过程（进位、转肽、移位）在真核和原核生物中非常相似，核心机制保守。主要差异在于延伸因子的命名和数量/复杂性。
- 共同核心步骤：
- 进位 (A 位点结合)： 正确的氨基酰-tRNA (aa-tRNA) 在延伸因子帮助下进入核糖体 A 位点，其反密码子与 mRNA 密码子配对。
- 转肽 (肽键形成)： 核糖体大亚基的肽基转移酶中心催化 P 位点 tRNA 上肽链（或起始氨基酸）的羧基与 A 位点 aa-tRNA 上氨基酸的氨基之间形成肽键。肽链转移到 A 位点 tRNA 上。
- 移位： 核糖体沿 mRNA 向 3’端移动一个密码子。原来在 A 位点、携带新生肽链的 tRNA 移至 P 位点；原来在 P 位点、空载的 tRNA 移至 E 位点；下一个密码子进入空出的 A 位点。E 位点的空载 tRNA 离开核糖体。
- 延伸因子：
- 原核生物：
- EF-Tu (热不稳定延伸因子， GTPase): 主要延伸因子。它结合除起始 fMet-tRNA 外的所有 aa-tRNA（以 EF-Tu•GTP•aa-tRNA 三元复合物形式），保护不稳定的酯键，并将其运送到核糖体 A 位点。密码子-反密码子正确配对诱导 EF-Tu 水解 GTP，导致其构象改变并从核糖体释放，aa-tRNA 完全进入 A 位点参与肽键形成。
- EF-Ts (热稳定延伸因子)： 作为鸟苷酸交换因子 (GEF)，催化 EF-Tu•GDP 中的 GDP 释放并重新结合 GTP，使其再循环。
- EF-G (GTPase)： 催化移位过程。其结合和水解 GTP 驱动核糖体构象变化，使其沿 mRNA 移动一个密码子。
- 真核生物：
- eEF1A (类似原核 EF-Tu， GTPase)： 结合并运送 aa-tRNA（eEF1A•GTP•aa-tRNA）到 A 位点。密码子识别后 GTP 水解，eEF1A•GDP 释放。
- eEF1B (类似原核 EF-Ts， GEF)： 促进 eEF1A•GDP 中 GDP 的释放和 GTP 的结合，使其再循环（eEF1B 由多个亚基组成，如α, β, γ）。
- eEF2 (类似原核 EF-G， GTPase)： 催化移位过程。其结构和功能与 EF-G 高度同源，同样利用 GTP 水解的能量驱动移位。
- 原核生物：
六、终止 (Termination)
终止过程在两者中也非常相似：当核糖体移动到 mRNA 的终止密码子（UAA, UAG, UGA）时，没有对应的 tRNA 能进入 A 位点。释放因子（Release Factors, RFs）识别终止密码子并催化新生肽链从 P 位点 tRNA 上水解释放，随后核糖体亚基解离。
- 释放因子：
- 原核生物：
- I 类 RF (具有肽基-tRNA 水解酶活性)：
- RF1: 识别终止密码子 UAA 和 UAG。
- RF2: 识别终止密码子 UAA 和 UGA。
- 功能： RF1/RF2 结合 A 位点的终止密码子，诱导肽基转移酶中心构象改变，使其具有水解酶活性，催化 P 位点 tRNA 上新生肽链与 tRNA 之间的酯键水解，释放多肽链。
- II 类 RF (GTPase，促进 I 类 RF 释放和核糖体回收)：
- RF3 (GTPase)： 结合 GDP。在 RF1/RF2 完成肽链释放后，RF3 结合核糖体，促进 RF1/RF2 的释放（需 GDP→GTP 交换）。随后 RF3 水解 GTP，自身也从核糖体释放。最终核糖体在核糖体回收因子（RRF）和 EF-G 作用下解离为大小亚基。
- I 类 RF (具有肽基-tRNA 水解酶活性)：
- 真核生物：
- I 类 RF：
- eRF1： 多功能因子。它能识别所有三种终止密码子 (UAA, UAG, UGA)；同时具有肽基-tRNA 水解酶活性，催化肽链释放。
- II 类 RF (GTPase)：
- eRF3： 结合 GTP。它与 eRF1 形成复合物（eRF1•eRF3•GTP）结合到终止密码子占据的 A 位点上。eRF1 催化肽链释放后，eRF3 水解 GTP，导致构象改变，促进 eRF1 和自身从核糖体释放。随后核糖体在 eIF3、eIF1、eIF3j 等因子帮助下解离回收（真核的核糖体回收机制比原核更复杂）。
- I 类 RF：
- 原核生物：
七、核糖体结构与抑制剂敏感性
- 核糖体大小：
- 原核生物： 70S 核糖体 = 30S 小亚基 (16S rRNA + 21 种蛋白质) + 50S 大亚基 (5S rRNA, 23S rRNA + 31 种蛋白质)。
- 真核生物（细胞质）： 80S 核糖体 = 40S 小亚基 (18S rRNA + ~33 种蛋白质) + 60S 大亚基 (5S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNA + ~46 种蛋白质)。
- 特点： 真核核糖体更大，rRNA 和蛋白质种类更多，结构更复杂。
- 抑制剂敏感性：
- 原核特异性抑制剂： 许多抗生素选择性作用于原核核糖体，如：
- 链霉素、卡那霉素、新霉素： 结合 30S 亚基，引起密码子错读或抑制起始。
- 四环素： 结合 30S 亚基 A 位点，阻止 aa-tRNA 进入。
- 氯霉素、林可酰胺类、大环内酯类（如红霉素）： 结合 50S 亚基肽基转移酶中心或肽通道，抑制肽键形成或肽链延伸。
- 真核特异性抑制剂： 较少，因为真核核糖体与哺乳动物宿主相似度更高。但也有如：
- 环己酰亚胺： 结合 60S 亚基 E 位点，抑制肽基转移酶活性（常用于实验室抑制真核翻译）。
- 蓖麻毒素、白喉毒素： 催化修饰真核延伸因子 eEF2（ADP 核糖基化），使其失活，阻断移位。
- 意义： 这种敏感性差异是抗生素治疗细菌感染的基础。
- 原核特异性抑制剂： 许多抗生素选择性作用于原核核糖体，如：
八、调控机制
- 原核生物：
- SD 序列强度： SD 序列与 16S rRNA 互补程度影响翻译起始效率。
- mRNA 二级结构： 起始位点周围的茎环结构可以隐藏 SD 序列或 AUG，阻碍核糖体结合或扫描。
- 反义 RNA/小 RNA (sRNA)： 可通过与 mRNA 特定区域（如 SD 序列）碱基配对，抑制核糖体结合。
- 蛋白质阻遏物： 可与 mRNA 结合，直接阻碍核糖体接近起始位点。
- 真核生物：
- eIF2 磷酸化 (全局调控)： 应激条件下（如病毒侵染、氨基酸饥饿、内质网应激、血红素缺乏），特定激酶磷酸化 eIF2α，抑制 eIF2B 活性，全局性降低翻译起始速率（除少数具有特殊 5’UTR 的 mRNA，如 ATF4）。
- eIF4F 复合物组装 (特异性调控)：
- mTORC1 通路： 营养充足、生长因子存在时激活，磷酸化 eIF4E 结合蛋白（4E-BPs），使其失活，释放 eIF4E，促进 eIF4F 复合物组装，整体增强帽依赖性翻译。
- eIF4E 磷酸化： 受 MNK 激酶调控，可能影响其与帽子或 eIF4G 的结合。
- eIF4E 可用性： 4E-BPs 在非磷酸化状态与 eIF4E 结合，阻止其与 eIF4G/eIF4A 形成 eIF4F 复合物，抑制帽依赖性翻译起始。
- mRNA 5’UTR 和 3’UTR 调控元件：
- 上游开放阅读框 (uORFs)： 位于主要 ORF 上游的小 ORF。扫描的核糖体可能起始并翻译 uORF，这会阻碍或延迟主 ORF 的翻译起始（如 GCN4 调控）。
- 内部核糖体进入位点 (IRES)： 某些病毒和细胞 mRNA 的 5’UTR 中存在特殊结构，允许核糖体在无帽情况下直接内部结合并起始翻译（绕过帽依赖机制）。
- 3’UTR 元件与结合蛋白： 3’UTR 中的特定序列（如 AU-rich elements, AREs）可被 RNA 结合蛋白（RBPs）识别，这些 RBPs 可招募抑制因子（如影响去腺苷酸化、促进降解）或激活因子（如促进环化，增强起始）来调控翻译效率和稳定性。PolyA 结合蛋白 PABP 通过与 eIF4G 相互作用促进 5’-3’环化，显著增强翻译起始效率。
- microRNAs (miRNAs)： 主要通过结合 mRNA 3’UTR，招募沉默复合物（如 RISC），导致 mRNA 降解或抑制翻译起始/延伸。
总结对比表
| 特征 | 原核生物 | 真核生物 |
|---|---|---|
| 空间位置/时间关系 | 偶联： 转录翻译均在细胞质，高度偶联，多顺反子 mRNA 可同时翻译多个蛋白。 | 分离： 转录核内，翻译胞质。成熟单顺反子 mRNA 转运至胞质后翻译。 |
| mRNA 5’端 | 无帽子。 多顺反子常见。 | 有 m⁷G 帽子。 单顺反子为主。 |
| 起始识别机制 | SD 序列依赖： 小亚基 16S rRNA 反 SD 序列与 mRNA SD 序列互补配对定位 AUG。 | 帽子依赖扫描： eIF4F 结合帽子，募集 43S 复合物，5’→3’扫描寻找 AUG（受 Kozak 序列影响）。IRES 提供替代机制。 |
| 起始密码子 | 通常为 AUG（少数 GUG/UUG） | 通常为 AUG |
| 起始 tRNA/首个氨基酸 | fMet-tRNAfᴹᵉᵗ / 甲酰甲硫氨酸 (fMet) | Met-tRNAiᴹᵉᵗ / 甲硫氨酸 (Met) |
| 起始因子 | 少 (IF1, IF2-GTPase, IF3) | 多且复杂 (eIFs, >12 种) 关键调控点: eIF2α磷酸化 (全局抑制), eIF4F 组装 (mTOR 调控, 影响帽依赖翻译效率)。 |
| 延伸因子 | EF-Tu-GTPase (运载 aa-tRNA), EF-Ts (GEF), EF-G-GTPase (移位) | eEF1A-GTPase (类似 EF-Tu), eEF1B (类似 EF-Ts), eEF2-GTPase (类似 EF-G) |
| 终止因子 | RF1 (UAA/UAG), RF2 (UAA/UGA), RF3-GTPase | eRF1 (识别所有终止密码子 + 水解肽链), eRF3-GTPase |
| 核糖体大小 | 70S (30S + 50S) | 80S (40S + 60S) |
| 主要 rRNA 组成 | 30S: 16S rRNA 50S: 5S, 23S rRNA | 40S: 18S rRNA 60S: 5S, 5.8S, 28S rRNA |
| 抑制剂敏感性 | 敏感于多种抗生素 (链霉素, 四环素, 氯霉素, 红霉素等) | 对多数原核抗生素不敏感。敏感于环己酰亚胺、蓖麻毒素、白喉毒素等。 |
| 主要调控机制 | SD 序列强度, mRNA 二级结构, 反义 RNA/sRNA, 蛋白质阻遏物。 | 全局: eIF2α磷酸化。 帽依赖: eIF4F 组装 (mTOR, 4E-BPs)。 mRNA 特异性: uORFs, IRES, 3’UTR 元件/RBPs (PABP, miRNAs), miRNAs 抑制。 |